Застосування біотехнологій дозволяє отримати оздоровлений садивний матеріал.
Підщепа — це фундамент плодового дерева, і саме від неї значною мірою залежить довговічність, швидкий вступ у плодоношення, врожайність, зимостійкість, посухостійкість і товарна якість плодів. Серед кісточкових порід черешнямає найбільшу силу росту, й добір для неї слаборослих підщеп є актуальною проблемою. Проблема підщепи для черешні була гострою завжди і всюди, оскільки традиційні насіннєві підщепи (сіянці антипки, дикої черешні та культурних сортів вишні і черешні) мали суттєві недоліки, щообмежували їх використання у низці регіонів.
На сьогодні в Україні широке розповсюдження отримали слаборослі підщепи GiSeLA-5, GiSeLA-6, ВСЛ-2 та Студениківська, їх занесено до «Державного реєстру сортів рослинпридатних для поширення в Україні».
Підщепа Студениківська є природною гібридною формою між вишнею степовою та вишнею звичайною (Cerasus fruticosa (Раll.) × Cerasus vulgaris Мill.), дерева на ній формують компактну, не загущену крону та мають меншу силу росту: порівняно з деревами на антипці — на 25–30%, на черешнідикій — на 35–45%. Підщепа добре суміщається із сортами, утвореним деревам властива морозостійкість та довговічність. Проте саджанці на цій підщепі у дефіциті. Одна з причин — проблеми з розмноженням підщепи. Її насіння погано проростає, а укорінювання зелених живців в тумано-установках — слабке й не перевищує 22–40%. Подібнітруднощі з розмноженням й у черешневих підщеп серії GiSeLA.
Мікроклони
Виготовлення мікроклонів є одним зі способів вегетативного розмноження садивного матеріалу. Порівняно з традиційними методами розмноження воно має ряд переваг.
Найперша — те, що отримується генетично однорідний садивний матеріал. А завдяки поєднанню меристемної культури з хемотерапією (коли в судинну систему рослин упорскують хімічні препарати) або з термотерапією, майбутні саджанці вдається звільнити від вірусів. Також цей спосіб має високу продуктивність: коефіцієнт розмноження садивного матеріалу для трав’яних і квіткових рослин –105 –106, для кущових і деревних рослин — та 104–105. Селекційний процес та перехід рослин від ювенільної до репродуктивної фази розвитку скорочується. Мікроклони — це ще і спосіб репродукувати рослини, що важко розмножуються традиційними способами. Саме розмноження можна виконувати протягом усього року (клімат лабораторій не знаєзміни сезонів). За потреби процес вирощування можна автоматизувати.
Як первинний експлант (відокремлену від материнськогоорганізму групу клітин) у мікроклонуванні зазвичай використовують верхівкові меристеми, тому метод ще має назву «культура меристем». Меристеми — це загальна назва для тканин рослин, які складаються з клітин, що інтенсивно діляться й зберігають фізіологічну активність протягом усього життя, забезпечуючи безперервне наростання маси рослини та надаючи матеріал для утворення спеціалізованих тканин.
Культура меристем — це асептичне вирощування на живильних середовищах ізольованої з апекса або пазушної бруньки пагона апікальної меристеми з одним або двома листковими зародками. Вирощування відбувається в закритих прозорих чи напівпрозорих культиваційних посудинах з обмеженою вентиляцією за штучного освітлення флуоресцентними лампами. Універсальних схем мікроклонального розмноження не існує. Для кожної сільгоспкультури технологію мікроклонування слід адаптувати окремо, зважаючина особливості її генотипу.
Практика мікроклонування
Усі роботи з мікроклонального розмноження рослин вимагають високого рівня стерильності і виконуються в спеціальних ламінар-боксах.
Технологія мікроклонального розмноження будь-якої культури включає чотири основні етапи: введення вихідної форми в стерильну культуру, власне мікророзмноження, укорінення розмножених мікропагонів, переведення стерильної культури у ґрунт. Інститут садівництва НААН опрацював технологію розмноження та оздоровлення підщеп GiSeLA-5, GiSeLA-6 і Студениківська.
Експланти для введення в культуру in vitro відбирають із безвірусних рослин на початку липня, коли спостерігався максимальний приріст однорічних пагонів. Як стерилізаційний агент застосовують 70%-й етанол та 0,1%-й розчин хлориду ртуті (HgCl2), експозиція стерилізації: 45 сек для етанолу та 3 хв для HgCl2. Регенеровані на етапі введення в культуру in vitro мікропагони культивують на модифікованому середовищі Мурасіге–Скуга (MS) за pH 5,7 і з додаванням вітамінів і фітогормонів. Для індукції пагоноутворення до складу середовища додають 0,5 мг/л цитокінінубензиламінопурину (БАП) та 0,5 мг/л гіберелової кислоти.За таких умов середній коефіцієнт пагоноутворення становив 4,13 пагонів на експлант (фото 1).
Під час мікроклонального розмноження важливим є ризогенез (утвореня коренів). Для укорінення відбирають мікропагони завдовжки понад 10 мм. Як індуктори ризогенезу застосовують ауксини. Щоб зняти інгібіторний вплив БАП на коренеутворення, мікропагони згодом пересаджуютьна середовище, яке не містить жодних регуляторів росту. Культивування за таких умов триває два тижні, після чого рослини пересаджують на середовище з індолілмасляною кислотою (ІМК). За правильно виконання всіх процедур укорінюється 80–90% рослин (показник залежить від концентрації ауксину). Максимальна кількість укорінених мікропагонів утворюється на середовищі, що містить 1 мг/л ІМК, рослини та їх корені мають нормальну морфологію (фото 2) і придатні для подальшої адаптації та акліматизації.
Життя без скла
Головною проблемою мікроклонального розмноження є адаптація мікропагонів до нестерильних умов. У рослин, вирощених в умовах in vitro, слабо розвинена провідна система ксилеми та продиховий апарат. Загалом приживлюваність регенерантів залежить від здатності мікропагонів витримувати низьку вологість. Оскільки листові пластинки позбавлені епікутикулярного воску, то за перенесення з умов in vitro в умови ex vitro вони швидко зневоднюються й гинуть.Тому вибір умов адаптації має надзвичайне значення.
Укорінені рослини підщеп, що досягли розміру 1,5–2 см, адаптують на збагаченому кальцієм та макро- і мікроелементами торф’яному субстраті за рН 5,4–6. На початку адаптації вологість повітря має сягати 90%, протягом першого тижня її поступово знижують. Під час адаптації підщепи дуже чутливі до температури. Найбільш сприятливий діапазон+18…+21 °C. За таких умов адаптувалося 87%.
Вплив хвороб
Культивування черешні за інтенсивними технологіями вимагає і якісних змін в культурі садівництва, зокрема використання лише здорового садивного матеріалу. Адже вирощування саджанців на інфікованих вірусами підщепах у комбінуванні з чутливими до вірусів прищепами може не лише знизити економічну ефективність насаджень, а й призвести до загибелі саду. Тому фітовірусологічний статус садивного матеріалу має критичне значення. Сучасне виробництво якісного садивного матеріалу тісно пов’язане зі здобутками біотехнології — зокрема, для діагностикивірусних хвороб проводять імуноферментний аналіз (ІФА).Методику застосовують під час виділення вихідних базових безвірусних клонів та для прискореного розмноження й оздоровлення садивного матеріалу від бактеріальної та грибної інфекцій. Йдеться про розмноження in vitro в культурі верхівкових меристем.
Вивчення інтродукції підщеп типу GiSeLA у вітчизняних садах свідчить про їх високу чутливість до інфікування вірусом скручування листя черешні (ВСЛЧ, Cherry leaf rollvirus). Наслідком дії хвороби є деформація та скручування листків черешні і вишні, прижилкова мозаїчність, окремі гілки, а часом й усе дерево, спиняють свій ріст та гинуть.
НЕПО-віруси (переносники — нематоди), до яких належить і ВСЛЧ, здатні колонізувати меристемні тканини, тим самим знижуючи терапевтичний ефект методу культури тканин. Саме тому мікроклонування поєднують з термочи хемотерапією. Для останньої найбільш ефективними є синтетичні аналоги пуринових і піримідинових основ, ферменти рибонуклеази тощо. Проте через їх мутагенність тависоку вартість виникла потреба пошуку інших препаратів з антивірусною активністю. Багато рослин містять саліцилову кислоту (СК) — природний фенольний компонент, що регулює фізіологічні процеси, має прямий вплив на синтез вірусів і сприяє елімінації X-вірусу картоплі, вірусів мозаїки банана, хлоротичної плямистості листя яблуні.
Ми спробували оцінити можливості оздоровлення підщепи GiSeLA 6, інфікованої вірусом скручування листя черешні, додаванням саліцилової кислоти в середовище для культивування мікропагонів. Також ми виявили лінійну залежність між вмістом СК у живильному середовищі та падінням концентрації ВСЛЧ в експлантах підщепи GiSeLA 6. В концентрації 20 мг/л саліцилова кислота знижує титр вірусу скручування листя черешні в інфікованих експлантатах підщепи GiSeLA 6 на 87%. Ці дослідження тривають, випробовуються інші противірусні препаратита їх концентрації, щоб досягти повного видалення вірусу з інфікованих експлантів.
Тамара Мєдвєдєва, канд. біол. наук,
Світлана Васюта, канд. с.-г. наук,
Інститут садівництва НААН України
журнал “Садівництво по-українськи”, грудень 2015 року
Усі авторські права на інформацію розміщену у журналі “Садівництво по-українськи” та інтернет-сторінці журналу за адресою https://agrotimes.ua/journals належать виключно видавничому дому «АГП Медіа» та авторам публікацій, згідно Закону України “Про авторське право та суміжні права”.
Використання інформації дозволяється тільки після отримання письмової згоди від видавничого дому «АГП Медіа».
Садівництво по-українськи
